Канцерогенезата се изучава с различни стандартизирани токсикологични тестове. Първа част от тези тестове се провеждат in vitro и - ако са положителни - продължаваме с експеримент in vivo. Този експериментален подход стъпка по стъпка се нарича ПОДХОД НА ТОЧКА НА РЕШЕНИЕ, поредица от опити, които спират в края на всеки опит, за да решат как да продължат с изпитването. Има пет етапа:
ЕТАП А: структура и характеристики на канцерогенното съединение;
ФАЗА: в тази фаза на краткосрочни in vitro тестове се използват клетки на бозайници. Най -често използваните клетки са хепатоцитите, тъй като се изследва степента на възстановяване на увреждането, което хепатоцитът развива според тежестта на увреждането, причинено от веществото. Накратко, ние определяме не самото увреждане, а колко от системата за възстановяване е активирана от чернодробната клетка.
Приложената процедура е да се образуват 3 хепатоцитни култури. В първата култура хепатоцитите са здрави, във втората те се третират с изпитваното вещество и накрая в третата те се третират с контролно вещество, което със сигурност е канцерогенно.Тези три култури съдържат радиоактивна пиримидинова основа, която е тритиев тимидин, който действа като маркер.
Ако изследваното съединение причини мутация в ДНК, клетката реагира на този проблем, като активира възстановителните системи. Парчето ДНК, което е претърпяло мутацията, се отрязва и благодарение на действието на ДНКполимеразата липсващото парче се заменя с ново.За корекцията ДНКполимеразата използва новите основи, включително тритиев тимидин. Анализът на радиоактивността определя нивото на мутация в третираните клетки: колкото по -висока е радиоактивността, толкова по -големи са ДНК мутациите.
Също така във фаза В се извършват и тестове върху бактерии, за да може да се проучи дали има обратни мутации. Използваните бактерии са салмонели, вече носители на мутации. Мутацията се отнася до синтеза на хистидин, така че салмонелите не могат да растат без хистидин. Тези бактериални колонии се вземат частично за третиране с изпитваното вещество, отчасти за отрицателната контрола и отчасти за положителната контрола, след което се тестват с известен канцероген. Ако това изпитвано вещество е непряко генотоксично, метаболизиращите ензими трябва да бъдат въведени в хранителната среда. На този етап има 3 култури, които ще бъдат посяти и отглеждани в петриеви чаши (няма хистидин в хранителната среда). Ако не е имало никакви мутации от канцерогена за тестване, на теория не би трябвало да има такива върху плочите . Ако е имало мутагенно действие на канцерогена, той може да е променил първата мутация и да е създал втора мутация, способна да отглежда бактериите върху свободна от хистидин културна среда. В този случай втората мутация, която модифицира първата мутация и приема името на РЕТРОМУТАЦИЯ И накрая, ако в piasta petri настъпи значителен растеж, канцерогенът е директен.
Винаги с in vitro тест е възможно да се определи хромозомната цялост.Този тест винаги се провежда върху клетки на бозайници и се използва за тестване на токсични вещества, способни да причинят мутации на някои ензими, отговорни за биосинтеза на ДНК. се подлага на in vitro анализ За да може да се определи дали изследваното вещество засяга целостта и броя на присъстващите хромозоми, се използва микроядреният тест. Микроядрата са везикули, които са образувани с част от хроматина вътре. Хроматинът, включен в тези микроядра, може да бъде или цели хромозоми, или фрагменти от хромозоми. Резултатът от този тест ще бъде определянето на вещества, които са дефинирани кластогенни и вретенови отрови. Кластогенното вещество произвежда микроядра с ацентрични фрагменти от хромозоми, така че веществото предизвиква счупване в хромозомите, вместо отровното вещество на вретеното произвежда микроядрата, които вътре в него присъстват цели хромозоми.
Ако изследваното вещество индуцира генотоксичност в един или повече тестове, това се определя като силно подозрително, така че преминава директно във фаза D. Ако, от друга страна, изпитваното вещество не предизвиква генотоксичен ефект, преминава във фаза на изследване C, защото може да бъде промотор.
FASEC: в тази фаза могат да се извършват както in vitro, така и in vivo тестове.
За in vitro тестове може да се докаже възможността промоторното вещество да прекъсне пролуките между нормалните клетки и туморните клетки, с последващо преминаване на вещества между двете клетки.
In vivo тест е индуцирането на кожни тумори при мишки. Веществото, което ще се тества, се нанася два или три пъти седмично върху кожата на мишката. В рамките на 2/3 месеца, ако това вещество е промотор, може да има папиломни образувания. При мишки се вземат предвид две основни данни: броят на мишките, засегнати от папиломи, и броят на папиломите, присъстващи на всяко животно. Ако веществото действа като промотор и развива тумор в третираната мишка, това означава, че наистина е вещество с промоторен ефект.
След като тези тестове приключат, преминаваме към дългосрочни in vivo тестове.
FASED: в тази фаза се изпитват всички съединения, които се оказват мутагенни и всички съединения, които не се доказват като мутагенни. Тестовете, които могат да бъдат извършени, са различни, някои от които са тестове, проведени върху черния дроб, върху белия дроб и накрая върху гърдата.
Чернодробният тест показва образуването не на новообразуван тумор, а на неопластичен фокус, следователно нещо, което се готви да се превърне в тумор. Клетките от този фокус вече са атипични клетки, поради което са претърпели мутация и се подготвят да се превърнат в неопластични клетки. След определено време, благодарение на аутопсионното изследване, се определя образуването на пренеопластични фокуси, като се изчислява броят и обхватът на тези преднеопластични образувания.
Белодробният тест позволява определянето на аденом, който е "аномалия на клетките на белодробната тъкан. Също така в този случай белодробната тъкан на плъха се изследва след доста дълго време (месеци) (тези аденоми са лесно идентифицируеми, тъй като са белезникави възли на белодробния епител).
Тестът на гърдата позволява определяне на тумори в жлезистата тъкан. Броят на образуваните аденоми и броят на животните с аденоми винаги се оценяват.
Ако има положителни резултати от тези тестове, изпитваното вещество наистина е канцероген. На този етап преминаваме към провеждане на скъпи тестове с много дълго време за изпълнение.
ФАЗА: в тази фаза променлив брой животни, от 20 до 50, се подлагат на дългосрочни тестове.Тези тестове са много скъпи и отнемат много време, за да се получат определени резултати; говорим за около 1/8 от живота на животното.Възможно е по време на процеса на тези тестове някои животни да умрат, но те винаги се изследват с аутопсия и хистологично изследване на типа. Избраните животни винаги са плъхове и мишки и само 70-80% оцеляват до края на дългосрочните тестове. Използваните животни просто се отбиват, колкото по -млади са, толкова по -чувствителни са към лечението. По време на дългосрочния период на изпитване изследователят винаги е подпомаган от математик-статистик, способен да вземе предвид цялата събрана информация и да възпроизведе различните данни.
Дозите, тествани върху животни, започват от максимално поносимата доза и всички нейни помножени и се оценява реакцията доза-отговор при животното.
Прилагането винаги трябва да се доближава до пътя, по който мъжът може да влезе в контакт с изследваното вещество, следователно орален, кожен или респираторен път, докато ако се тества канцерогенността на лекарството, е полезно да се извърши и интравенозно приложение.
Тестваните групи животни са 4 (по 50 животни за всяка група):
- Група NAIF, която няма лечение;
- Група, третирана с превозното средство;
- Група, третирана с изпитваното вещество;
- Група, третирана с известен канцероген.
Много е важно броят на животните във всяка група да е възможно най -равен.Всъщност, ако има твърде голяма разлика в броя на животните, статистическият тест може да се окаже фалшив.
Извършените оценки са:
- Обща честота на тумори;
- Честота на някои тумори;
- Честота на животни с повече от един вид тумор;
- Брой ракови заболявания при животни.
В края на всички тези фази на изследване, веществото е класифицирано в класация, установена от IARC (Международната агенция за изследвания и развитие на рака) и от Агенцията за опазване на околната среда (EPA).
Други статии на тема „Изследване и оценка на канцерогенезата“
- Канцерогенеза
- Токсичност и токсикология
- Токсикология и тератогенеза на репродуктивния цикъл